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Hiper Canace HF DNA Polymerase是新一代的高保真DNA聚合酶。该酶基于Pyrococcus Furiosis DNA Polymerase，经基因工程改造而成。其蛋白结构包含5’→3’聚合酶结构域和经过改造的3’→5’外切酶结构域。这种组合大幅度提升了酶的耐热性，保真性。耐热温度达到98℃，保真性是Taq DNA聚合酶的52倍，普通Pfu DNA聚合酶的6倍。酶溶液中添加了独特的延伸因子，扩增速度达到15sec/kb。本制品配备了优化后的酶缓冲液，添加了PCR增强组分，使得该酶具有极强的扩增效率和广泛的模板适应性，非常适合复杂模板的扩增。扩增产物为平末端。

• 核酸外切酶残留检测：10U本制品和0.5μg λDNA(Hind III)，37℃下孵育4h，DNA的电泳谱带无变化。
  
• 切口酶残留检测：10U本制品和0.5μg IL23R质粒，37℃下孵育4h，DNA的电泳谱带无变化。

• PCR反应体系(推荐冰上配制)
  

  成分	用量	终浓度
  H2O	至50μL	-
  2×Canace PCR buffer (含Mg2+，dNTPs)	25μL	1×
  DNA模板	适量	-
  Primer正向(10μM)	2.5μL	0.5μM
  Primer反向(10μM)	2.5μL	0.5μM
  Hiper Canace HF DNA Polymerase(2U/μL)	0.5μL	1U/50μL

  注：
  
  • 试剂使用：使用前要充分解冻混匀。
    
  • 聚合酶浓度：推荐使用1U/50μL。可以在0.5～2U/50μL之间进行优化，请勿超过2U/50μL。
    
  • 聚合酶添加：为了防止聚合酶因3’→5’外切酶活性降解引物，建议将聚合酶在最后一步加到反应体系中。
    
  • Mg²⁺终浓度：体系终浓度为1.5mM。如有特殊需要，可用50mM MgCl₂，以0.2～0.5mM为间隔向上摸索。
    
  • 高GC模板：在体系中加入终浓度为3%的DMSO可能有利于扩增。
    
  • 不同模板的推荐使用量(50μL反应体系)：

    模板种类	扩增片段1kb～20kb
    基因组DNA	50ng～200ng
    质粒或病毒DNA	10pg～20ng
    cDNA	1～5μL (不超过PCR反应总体积的1/10)

• PCR扩增程序

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	98℃	0.5～3min	1
  变性	98℃	10sec	30-35
  退火	60℃	20sec
  延伸	72℃	15～30sec/kb
  终延伸	72℃	5min	1

  注：
  
  • 预变性温度和时间：推荐使用98℃。预变性推荐时间：质粒DNA等简单模板为30sec；cDNA、基因组DNA等复杂模板为3min；高GC含量模板为5～10min。
    
  • 退火温度和时间：推荐使用60℃，也可根据需要，设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间设置为20sec，可以在10～30sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
    
  • 延伸温度和时间：推荐使用72℃。延伸时间推荐如下：质粒DNA等简单模板为15sec/kb；cDNA、基因组DNA等复杂模板为30sec/kb，根据实际情况可延长至40sec/kb。
    
  • 扩增产物：请将PCR扩增产物放置于-20℃保存，防止该酶降解扩增产物。扩增产物为平末端，产物直接用于克隆，请使用平末端连接载体。